با پاندمی شدن آنفولانزاجدید H1N1جدید (H1N1 2009) امروزه استفاده کردن از روش های تشخیصی سریع و مطمئن از اهمیت خاصی برخوردار شده است. اما در ابتدا لازم است آشنایی مختصری با این ویروس داشته باشیم.
ویروس آنفولانزا و انواع آن:
در طبقه بندی ویروس ها ، ویروس آنفولانزا از جمله ویروس های خانواده اورتومیکسو ویریده است که برخلاف بیشتر ویروس های RNA دار که در سیتوپلاسم تکثیر می کنند در داخل هسته تکثیر می یابند.
ساختار ویروس
ویروس انفولانزا اغلب دارای ساختار کروی خشن با قطری در حدود 120-80 نانومتر می باشد اما گاها به شکل رشته ای نیز دیده می شود. در ساختار مرکزی ویروس RNA تک رشته ای با پلاریته منفی به همراه پروتئین های محافظت کننده وجود دارد. RNA ویروس عموما تک رشته ای و از8-7 قطعه تشکیل شده است که هر یک از قطعات خود حاوی 2-1 ژن میباشد به طور مثال ژنوم آنفولانزا نوع A دارای 8 قطعه و 11ژن می باشد که 11 نوع پروتئین ویروس را با نام های زیر کد می کند:
HA NA NP M1 M2 NS1 NS2
PA PB1 PB1-F2 PB2
HA:هماگلوتینین،یک نوکلئوپروتئین غشایی میباشد که با اتصال به اسید سیالیک سطح غشا سلول های اپیتلیال موجود در مجرای تنفسی باعث اتصال ویروس به سلولهای میزبان و الوده نمودن سلولها نقش میشود.
NA: نورامینیداز نیز همانند HA نوکلئوپروتئینی غشایی بوده که باعث شکسته شدن اسید سیالیک غشایی و در نتیجه انتشار ویروس به سایر سلولهای میزبان میشود.
HA * و NAاز اهداف اصلی داروهای انتی ویروس در درمان انفولانزا میباشد.
M2: نقش کانال یونی غشایی را دارد و در جریان همانند سازی ژنوم ویروس با انتقال یونهای H از غشا باعث ایجاد شرایط اسیدی در سلول و کمک به همانند سازی ویروس میشود.
بر اساس تفاوت در پروتئین غشایی M2 ویروس آنفولانزا به سه نوع زیر تقسیم می شود :
آنفولانزا نوع A : پرندگان وحشی آبی میزبان طبیعی برای انواع وریته آنفولانزا نوع A هستند اما گاهی اوقات ویروس به دیگر گونه ها از جمله جمعیت های خانگی و اهلی مانند رندگان ، خوک ، اسب و برخی از حیوانات دریایی مانند فوک انتقال یافته و یا باعث ایجاد پاندمی مرگ زای در انسان می گردد .
آنفولانزا نوع B : منحصرا انسان را آلوده میکند اما فوک و راسو نیز حیوانات مستعد شناخته شده اند. کمتر از نوع A عمومیت دارد.
آنفولانزا نوعC : انسان ، سگ و خوک را آلوده می کند گاها" باعث ایجاد بیماری شدید و اپیدمی های منطقه ای می گردد آنفولانزا نوع C بیشتر در کودکان و کمتر از دو نوع دیگر رخ می دهد .
سروتیپ های آنفولانزا :
بر اساس تولید آنتی بادی علیه پروتئین های غشایی هماگلوتینن HA و نوروآمینیداز NA ویروس انفولانزا نوع A، B وC به سروتیپ های مختلفی تقسیم میشود که در این میان نوع A دارای 16 سروتیپ و نوع B و Cتنها دارای یک نوع سروتایپ هستند، سروتیپ های نوع A شامل :
H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1,
H7N2 ,H7N3, H9N2, H10N7 ,….
انفولانزا خوکی کلیه سروتیپهای ویروس انفولانزا میباشد که در بین جمعیت خوکها اندمی شده و ایجاد بیماری مینماید و گاها نیز انسان را الوده میکند
روش های تشخیص آنفولانزا :
شماری از روش های آزمایشگاهی برای شناسایی و تشخیص آنفولانزا وجود دارد که از حساسیت و اختصاصیت های متفاوتی در افتراق آنفولانزا نوع A از B وC و یا افتراق زیرگونه های نوع A (همانند افتراق H1N1 فصلی از H1N1 جدید 2009 ) برخوردار هستند این روش ها شامل :
1- روش تشخیصی RIDTs
2- روش ایمنوفلورسانس مستقیم DFAs
3- کشت ویروس Viral Culture
4- روش ملکولی Real timeRT – PCR
روش تشخیصی سریع RIDTs ( (Rapid Influenza Diagnostic Test:
این تست ها قابلیت ردیابی نوکلوپروتئین های ویروسی را دارند و از جمله ویژگی های آنها اختصاصیت 95 % و اعلام نتیجه در کمترین مدت زمان ممکنه است. این تست ها را بر اساس قابلیت افتراقی شان به سه دسته زیر تقسیم می کنند :
1- تست های که آنفولانزا نوع A را تشخیص می دهند.
2- تست های که دو نوع A وB را از یکدیگر تشخیص و افتراق می دهند
3- تست های که آنفولانزا نوع A وB را تشخیص می دهند اما قابلیت افتراق این دو نوع را از یکدیگرندارند.
روش ایمنوفلورسانس مستقیم DFAs
Direct immunofluorescence assays )):
این روش نیز مانند روش RIDTs قابلیت تشخیص آنتی ژن ویروس را دارند و از جمله ویژگی آن اختصاصیت 96 % و قابلیت تشخیص و افتراق دو نوع A وB در مدت زمان 4-2 ساعت دارد .
معایب این دو روش :
1. حساسیت RIDTs و DFAs در ردیابی H1N1 جدید در مقایسه با RT – PCR بترتیب ( 70-10 %) و ( 93-47 %) است.
2. به دلیل ایجاد پاسخ های منفی کاذب نتایج منفی آنها قابل اعتماد نیستند .
3. کلیه نتایج منفی و گاها" نتایج مثبت تست های RIDTs و DFAs بایستی با RT – PCR تایید شوند .
3-- کشت ویروس:
در این روش با استفاده از محیط های اختصاصی و افتراقی کشت ویروس مانند MDCK (Madin-Darby caine kidney)
می توان انواع آنفولانزا و زیر گونه های آن را از یکدیگر تشخیص و افتراق داد .
4- روش ملکولی RT – PCR Real time :
این روش که بر اساس تکثیر اسیدهای نوکلئیک قطعه ای از DNA و یا RNA ژنومی استوار است .، از اختصاصیت و حساسیت بالای برخورداراست و قابلیت تشخیص و افتراق انواع آنفولانزا و زیر گونه های آن را از یکدیگر دارد .
معایب این دو روش :
محدودیت و جواب دهی طولانی مدت از معیاب آن است .
نکته : هیچ کدام از تست های RIDTs و DFAsقابلیت تشخیص آنفولانزا نوع A (H1N1 و H3N2 فصلی و دیگر سرو تایپ های آنفولانزای نوع A را از H1N1 جدید 2009 ) ندارند .
ویروس آنفولانزا و انواع آن:
در طبقه بندی ویروس ها ، ویروس آنفولانزا از جمله ویروس های خانواده اورتومیکسو ویریده است که برخلاف بیشتر ویروس های RNA دار که در سیتوپلاسم تکثیر می کنند در داخل هسته تکثیر می یابند.
ساختار ویروس
ویروس انفولانزا اغلب دارای ساختار کروی خشن با قطری در حدود 120-80 نانومتر می باشد اما گاها به شکل رشته ای نیز دیده می شود. در ساختار مرکزی ویروس RNA تک رشته ای با پلاریته منفی به همراه پروتئین های محافظت کننده وجود دارد. RNA ویروس عموما تک رشته ای و از8-7 قطعه تشکیل شده است که هر یک از قطعات خود حاوی 2-1 ژن میباشد به طور مثال ژنوم آنفولانزا نوع A دارای 8 قطعه و 11ژن می باشد که 11 نوع پروتئین ویروس را با نام های زیر کد می کند:
HA NA NP M1 M2 NS1 NS2
PA PB1 PB1-F2 PB2
HA:هماگلوتینین،یک نوکلئوپروتئین غشایی میباشد که با اتصال به اسید سیالیک سطح غشا سلول های اپیتلیال موجود در مجرای تنفسی باعث اتصال ویروس به سلولهای میزبان و الوده نمودن سلولها نقش میشود.
NA: نورامینیداز نیز همانند HA نوکلئوپروتئینی غشایی بوده که باعث شکسته شدن اسید سیالیک غشایی و در نتیجه انتشار ویروس به سایر سلولهای میزبان میشود.
HA * و NAاز اهداف اصلی داروهای انتی ویروس در درمان انفولانزا میباشد.
M2: نقش کانال یونی غشایی را دارد و در جریان همانند سازی ژنوم ویروس با انتقال یونهای H از غشا باعث ایجاد شرایط اسیدی در سلول و کمک به همانند سازی ویروس میشود.
بر اساس تفاوت در پروتئین غشایی M2 ویروس آنفولانزا به سه نوع زیر تقسیم می شود :
آنفولانزا نوع A : پرندگان وحشی آبی میزبان طبیعی برای انواع وریته آنفولانزا نوع A هستند اما گاهی اوقات ویروس به دیگر گونه ها از جمله جمعیت های خانگی و اهلی مانند رندگان ، خوک ، اسب و برخی از حیوانات دریایی مانند فوک انتقال یافته و یا باعث ایجاد پاندمی مرگ زای در انسان می گردد .
آنفولانزا نوع B : منحصرا انسان را آلوده میکند اما فوک و راسو نیز حیوانات مستعد شناخته شده اند. کمتر از نوع A عمومیت دارد.
آنفولانزا نوعC : انسان ، سگ و خوک را آلوده می کند گاها" باعث ایجاد بیماری شدید و اپیدمی های منطقه ای می گردد آنفولانزا نوع C بیشتر در کودکان و کمتر از دو نوع دیگر رخ می دهد .
سروتیپ های آنفولانزا :
بر اساس تولید آنتی بادی علیه پروتئین های غشایی هماگلوتینن HA و نوروآمینیداز NA ویروس انفولانزا نوع A، B وC به سروتیپ های مختلفی تقسیم میشود که در این میان نوع A دارای 16 سروتیپ و نوع B و Cتنها دارای یک نوع سروتایپ هستند، سروتیپ های نوع A شامل :
H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1,
H7N2 ,H7N3, H9N2, H10N7 ,….
انفولانزا خوکی کلیه سروتیپهای ویروس انفولانزا میباشد که در بین جمعیت خوکها اندمی شده و ایجاد بیماری مینماید و گاها نیز انسان را الوده میکند
روش های تشخیص آنفولانزا :
شماری از روش های آزمایشگاهی برای شناسایی و تشخیص آنفولانزا وجود دارد که از حساسیت و اختصاصیت های متفاوتی در افتراق آنفولانزا نوع A از B وC و یا افتراق زیرگونه های نوع A (همانند افتراق H1N1 فصلی از H1N1 جدید 2009 ) برخوردار هستند این روش ها شامل :
1- روش تشخیصی RIDTs
2- روش ایمنوفلورسانس مستقیم DFAs
3- کشت ویروس Viral Culture
4- روش ملکولی Real timeRT – PCR
روش تشخیصی سریع RIDTs ( (Rapid Influenza Diagnostic Test:
این تست ها قابلیت ردیابی نوکلوپروتئین های ویروسی را دارند و از جمله ویژگی های آنها اختصاصیت 95 % و اعلام نتیجه در کمترین مدت زمان ممکنه است. این تست ها را بر اساس قابلیت افتراقی شان به سه دسته زیر تقسیم می کنند :
1- تست های که آنفولانزا نوع A را تشخیص می دهند.
2- تست های که دو نوع A وB را از یکدیگر تشخیص و افتراق می دهند
3- تست های که آنفولانزا نوع A وB را تشخیص می دهند اما قابلیت افتراق این دو نوع را از یکدیگرندارند.
روش ایمنوفلورسانس مستقیم DFAs
Direct immunofluorescence assays )):
این روش نیز مانند روش RIDTs قابلیت تشخیص آنتی ژن ویروس را دارند و از جمله ویژگی آن اختصاصیت 96 % و قابلیت تشخیص و افتراق دو نوع A وB در مدت زمان 4-2 ساعت دارد .
معایب این دو روش :
1. حساسیت RIDTs و DFAs در ردیابی H1N1 جدید در مقایسه با RT – PCR بترتیب ( 70-10 %) و ( 93-47 %) است.
2. به دلیل ایجاد پاسخ های منفی کاذب نتایج منفی آنها قابل اعتماد نیستند .
3. کلیه نتایج منفی و گاها" نتایج مثبت تست های RIDTs و DFAs بایستی با RT – PCR تایید شوند .
3-- کشت ویروس:
در این روش با استفاده از محیط های اختصاصی و افتراقی کشت ویروس مانند MDCK (Madin-Darby caine kidney)
می توان انواع آنفولانزا و زیر گونه های آن را از یکدیگر تشخیص و افتراق داد .
4- روش ملکولی RT – PCR Real time :
این روش که بر اساس تکثیر اسیدهای نوکلئیک قطعه ای از DNA و یا RNA ژنومی استوار است .، از اختصاصیت و حساسیت بالای برخورداراست و قابلیت تشخیص و افتراق انواع آنفولانزا و زیر گونه های آن را از یکدیگر دارد .
معایب این دو روش :
محدودیت و جواب دهی طولانی مدت از معیاب آن است .
نکته : هیچ کدام از تست های RIDTs و DFAsقابلیت تشخیص آنفولانزا نوع A (H1N1 و H3N2 فصلی و دیگر سرو تایپ های آنفولانزای نوع A را از H1N1 جدید 2009 ) ندارند .